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作者：丛 容、王 俊、闻宏亮、乐 健、刘 浩
盐酸纳呋拉啡口溶膜溶出度检测方法建立
摘 要
准确评价药物的溶出度在口溶膜的质控方面具有重要意义，但传统桨碟法在评价口溶膜时与口腔实际生理条件差距过大，且方法区分力不足。该研究选择盐酸纳呋拉啡口溶膜为模型药物，采用闭环模式流池法构建溶出度检测方法，并优化了溶出介质、流速、玻璃珠等条件。同时，该研究设计了适用于 22.6mm 池体的口溶膜固定装置，用于防止口溶膜样品在试验过程中漂浮、黏附。结果显示，3批盐酸纳呋拉啡口溶膜采用设计的装置固定后，在以人工唾液为溶出介质、流速为4mL/min、玻璃珠填充6.5 g的条件下，均表现出平稳的溶出行为，变异性较低。相较于传统桨碟法，该试验过程不涉及机械搅拌，更符合口溶膜的实际释药环境，具有较好的区分力。
关 键 词
引 言
口溶膜制剂质地轻薄、便携、无需咀嚼吞咽，在口腔中即迅速释放，可显著提高患者用药的依从性和安全性。体外溶出试验可在一定程度上预测膜剂的体内性能、协助进行适口性评价、指导生物等效性试验。然而，原研药生产企业往往出于自身利益考量，会对最具区分力的内控方法试验条件加以保密，不少品种的溶出度试验方法及结果的表述都较为隐晦。在仿制药研发过程中，对原研制剂体外溶出行为的深度剖析和试验结果表明，许多已公布的溶出试验条件所得结果并不理想。
盐酸纳呋拉啡 (nalfurafine hydrochloride，1) 是由日本东丽株式会社研发的高选择性κ 受体激动药，通过降低尿毒症患者血清中β- 内啡肽/啡肽的比值来抑制μ受体过度激活。它可从机制出发，针对病因治疗慢性肾病相关性瘙痒 (chronic kidney disease-associated pruritus)，缓解患者的痛苦，被认为是局部治疗效果不佳患者的重要选择。查阅日本PMDA官网IF文件，原研厂家采用桨法评价1口溶膜原研药的溶出行为，桨板转速设置为50r/min，溶出介质体积为 900mL。前期研究结果显示，在此条件下，1口溶膜在4种不同pH值的溶出介质中的5min溶出度达85％以上。而FDA仿制药办公室在速释与缓控释制剂的2个研发模板中举例说明，溶出过快 (15min 溶出度 >85％)的试验方法，对仿制药质量和内在性能缺乏区分力。出于患者用药安全性的考虑，治疗窗相对较窄的药物常采用两点法拟定溶出度质量标准，即规定第一时间点溶出度不得超过某限度以防止药物突释，第二时间点溶出度不得少于某限度以保证溶出完全。例如卡马西平片，日本橙皮书数据库中拟定5min 时溶出度不得超过60％、30min时不得少于70％；USP 拟定10min溶出度应为30％～50％，45min时不得少于75％。
本研究根据NMPA药品审评中心于2025 年7月发布的《化学药品口溶膜剂药学研究技术指导原则 ( 试行 )》，参考《普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》，拟通过比较桨碟法和流池法，建立1口溶膜溶出度的评价方法，并使用3D打印技术设计膜片支架固定口溶膜片，优化流速、溶出介质等参数，以应对采用传统溶出度设备检测时口溶膜易漂浮、粘壁，以及溶出环境与口腔生理条件差异大等缺陷，旨在为该类剂型的溶出度质量标准拟定提供参考。
仪器与试药
DS-CP07 型流通池溶出仪 ( 深圳市华溶分析仪器有限公司 )；UDT-818 型全自动溶出仪 ( 美国 Logan 公司 ) ；SIL-20A 型高效液相色谱仪 ( 日本 Shimadzu 公司 ) ；XS205 DU型电子分析天平 ( 瑞士 Mettler Toledo 公司 )。
1对照品 ( 某公司，含量 99.3％，批号 ST-TAN-06) ；1口溶膜 ( 某企业，规格2.5μg，批号TC5412024001、 TC5412024002A、TC5412024002B)；空白口溶膜( 某公司 )；玻璃纤维滤膜 (GF/F 系列0.7μm和GF/D 系列2.7μm，美国Whatman 公司 ) ；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为自制纯化水。
方法与结果
3.1 HPLC 法的色谱条件
考虑到1口溶膜样品中的药物剂量低，每片含量仅2.5 μg，本研究采用二维液相色谱法检测1含量。
一维色谱条件：色谱柱 CAPCELL PAK C18 分析柱 (4.6mm×150 mm，5 μm) ；流动相25 mmol/L PBS(pH 4.5) 和甲醇 ( 体积比13∶7)，等度洗脱 ；流速 0.5mL/min ；柱温 40 ℃ ；检测波长280 nm ；进样体积1000 μL。
二维色谱条件：色谱柱CAPCELL PAK C18柱 (4.0 mm×10mm，5μm) ；流动相 25 mmol/L PBS (pH 9.3) 和甲醇 ( 体积比13 ∶ 7)，等度洗脱；流速1.0 mL/min ；柱温40 ℃ ；进样体积1000μL。
3.2 溶液配制
依据《普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》选择 4 种不同pH值的溶出介质，即pH 1.2盐酸、纯水、pH 6.8 PBS、pH 4.5乙酸盐缓冲液。另外，为模拟口腔生理条件，采用人工唾液作为溶出介质。
pH 1.2 盐酸 ：取浓盐酸 9 mL，加水稀释至 1000mL。
pH 6.8 PBS：取KH2PO4 3.4 g 和 Na2HPO4 3.55 g，溶于水1 000 mL 中；使用时用水按体积比1∶1稀释，用 10 moL/L 磷酸调至 pH 6.8。
pH 4.5 乙酸盐缓冲液：取乙酸钠1.22g、乙酸2.46 g， 溶于水 1 000 mL中，用乙酸调至 pH 4.5。
人工唾液：取NaCl 8g、KH2PO4 0.190 g、Na2HPO4 2.38g，溶于水1000mL 中，用10moL/L磷酸调至 pH6.6。
对照品溶液 ：精密称取 1 对照品 50 mg，加水溶解并定容至 50mL，即得 1mg/mL 1 贮备液。取1贮备液，分别用上述溶出介质以1 ∶ 100的梯度稀释为 100ng/mL 的1溶液；精密量取5mL，精密加入溶出介质和甲醇 ( 体积比19∶1) 的混合液95 mL，即得5ng/mL的1对照品溶液。
空白辅料溶液 ：取空白口溶膜，分别用上述溶出介质溶解并定容至500mL ；使用 2.7和0.7μm 玻璃纤维滤膜滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。
供试品溶液：取1口溶膜样品和上述溶出介质各100 mL，置500mL量瓶中，于25 ℃超声 (40 kHz) 2 min 使溶解，用相应的溶出介质定容，摇匀，使用2.7和 0.7 μm 玻璃纤维滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
3.3 方法学验证
3.3.1 稳定性、专属性和系统适用性
取供试品溶液，分别于室温放置 0、2、4、8、 12、18、24h时取样测定。结果显示，在水、pH 6.8 PBS、pH 4.5 乙酸缓冲液、人工唾液中，1峰面积的RSD 分别为 0.70％、0.23％、0.48％、0.35％，表明1 在这 4 种溶出介质中的稳定性良好。但在pH 1.2盐酸中，1峰面积的重现性不佳 ( 图 1)，故后续试验不使用pH 1.2盐酸作为溶出介质。
图1 1 在pH 1.2 盐酸中的色谱图(n=6）
取空白辅料溶液、供试品溶液、溶出介质，分别按“3.1”项下色谱条件进样检测。结果(图2)显示，在水、pH 6.8 PBS、pH 4.5 乙酸缓冲液、人工唾液中， 1 峰拖尾因子均 <1.5，理论塔板数均 >300 0。这说明辅料、溶出介质均不干扰本品测定。
图 2 1 在 4 种溶出介质中的专属性色谱图
3.3.2 线性试验
精密量取1贮备液5mL，用4种溶出介质分别稀释为0.5、1.5、3、4、5、6、7.5 ng/mL 的系列对照品溶液，按“3.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积 (A) 为纵坐标、1 质量浓度 (c) 为横坐标，进行线性回归。结果 ( 表1) 显示，在4种溶出介质中，1质量浓度在0.5 ～ 7.5 ng/mL与峰面积呈现良好的线性关系。
表1 1 在4 种溶出介质中的线性试验结果
3.3.3 回收率试验
精密量取1贮备液适量，分别用4种溶出介质稀释至0.25 μg/mL，精密量取2、5、10mL( 相当于标示量的20％、50％、100％)，置500mL量瓶中，分别加入空白口溶膜1片，用相应的溶出介质溶解并定容，摇匀，经2.7和0.7μm 玻璃纤维膜滤过，取续滤液，得1、2.5、5ng/mL 3种质量浓度的回收率溶液，每种平行制备3份。按“3.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，在水、pH 6.8 PBS、pH4.5乙酸盐缓冲液、人工唾液中，1平均回收率分别为100.4 ％、101.3 ％、99.8 ％、100.6 ％，RSD分别为0.46％、0.33％、0.65％、0.48％。
3.3.4 精密度试验
取1对照品溶液 (5 ng/mL)，照“3.1”项下色谱条件连续测定 5次。结果显示，在水、pH 6.8 PBS、pH 4.5 乙酸缓冲液、人工唾液中，1峰面积的RSD 分别为0.46％、0.94％、0.93％、0.34％，说明本法精密度良好。
3.3.5 重复性试验
取1口溶膜样品 ( 批号 TC5412024001)6 份，按“3.2”项下方法配制供试品溶液，照“3.1”项下色谱条件下连续进样检测。结果显示，在水、pH 6.8 PBS、pH 4.5 乙酸缓冲液、人工唾液中，1峰面积的RSD 分别为 0.85％、0.35％、0.29％、0.41％，表明本法重复性良好。
3.3.6 滤膜吸附效应考察
将供试品溶液稀释至 0.5、2.5、5 ng/mL 3 种质量浓度，分别离心 (5 590×g)10 min，取上清液，经2.7和0.7μm 玻璃纤维滤膜过滤；分别弃去0、1、2、 4、8、10 mL初滤液后取样，按“3.1”项下色谱条件进样测定，计算峰面积的 RSD，结果如表2所示。为保证试验过程中玻璃纤维滤膜对试验结果无影响，规定弃去初滤液2mL后取样。
表2 滤膜吸附试验结果
注：1) 表中仅展示符合要求的RSD值，此处指未弃去时RSD 已符合要求。
3.4 溶出度方法的建立
3.4.1 桨碟法
取1口溶膜样品 ( 批号TC5412024001)6片，照ChP 2025年版四部通则 0931第四法 ( 桨碟法 )的方法 2，以水、pH 6.8 PBS、pH 4.5乙酸缓冲液、人工唾液各 500mL为溶出介质，在温度37 ℃、转速50r/min的条件下试验。分别于2、5、10、15、 30、45、60 min 时取样2mL( 同时补充同温、等量溶出介质 )，按“3.1”项下色谱条件进样测定，按外标法以峰面积计算各时间点的溶出度，样品在4种不同介质中的溶出曲线如图3所示。观察到1口溶膜在4种溶出介质中的溶出速度均过快，5min内即进入平台期，因此需优化溶出条件，以减缓药物溶出速度。
以水为溶出介质，尝试将转速调至25r/min，结果如图3所示。虽然1溶出速率有所下降，但仍在10min 内释放完全，难以区分不同产品的内在性能。而进一步降低转速会使溶出介质搅拌不充分、溶出药物分散不均匀，导致取样结果与真实值差异较大，故桨碟法在评价1口溶膜溶出度时区分力不足，应采用其他方法。
图3 桨碟法测得的样品溶出曲线(n=6)
3.4.2 流池法
流池法中的溶出介质在输液泵作用下自下而上、平缓、匀速地冲刷药物表面，与采用传统机械搅拌方式相比，更能模拟口腔唾液生理环境。故以下尝试建立并优化流池法测定1口溶膜溶出度的方法。
3.4.2.1 玻璃珠构建方式
根据溶出介质的不同流通方式，流池法分为开环和闭环2 种模式。开环模式由于可在试验过程中始终保持漏槽条件，适用于检测难溶性样品；且可根据实际需要在试验过程中更换溶出介质，但介质体积需要量大。由于本研究样品规格较小，过程中无需变更溶出介质，故采用闭环模式进行试验。采用ChP 2025 年版四部通则0931 第六法(流池法)，以水500mL为溶出介质，在温度37 ℃、流速2mL/min 的条件下试验。分别于2、5、10、15、30、45、60min 时取样，按“3.1”项下色谱条件进样测定。当池体中无玻璃珠时，所得溶出曲线如图4所示 (n=6)。
图4 流通池无玻璃珠时测得样品溶出曲线(n=6)
由于未填充玻璃珠时，介质流动模式为湍流，流体粒子在多方向快速流动，均一性较差，且口溶膜未进行固定，易随溶出介质漂浮或粘在池壁上，导致前15min 各取样点数据离散度较大。在池体中填充玻璃珠，能使介质流动方式从湍流转变为层流，降低剪切力，更符合唾液的自然分泌模式。同时，也可将口溶膜插入或埋入玻璃珠中，对样品起到一定的固定作用。
图5 玻璃珠构建方式
设计如图5所示的6种不同玻璃珠构建方式，即将口溶膜样品以垂直、卷起、平铺的方式置入6.5或13g玻璃珠中，照上述方法以流池法进行试验，结果如图6所示。
图6 不同玻璃珠构建方式下测得的样品溶出曲线(n=6)
试验过程中观察到，采用方式1和2时，部分样品接触到溶出介质会在玻璃珠表面处折断，未插入部分随溶出介质漂浮或粘在池壁上，导致其数据离散度仍较高，提示这2 种构建方式对口溶膜的固定能力不佳。方式4和5虽能防止口溶膜折断，但插入深度、卷曲程度难以保持一致，人为干扰因素较大。方式3和6数据离散度较小，原因是埋片深度可通过称量玻璃珠的方法控制 ( 如先称取5g 玻璃珠，放入口溶膜样品后，再称取1.5或8g玻璃珠盖在样品上 )。同时，注意到方式3和6试验组的溶出速率较别组偏高，推测原因可能为口溶膜平铺在玻璃珠上，与介质流动方向垂直。考虑到构建的便利性和耗材使用量，选择方式 3进行后续对比。
3.4.2.2 固定装置的使用
针对口溶膜轻薄、易漂浮的特点，SPEER 等开发了3款适用于22.6 mm池体的口溶膜固定装置，分别采用夹子结构 ( 有/无背板结构 ) 和胶带粘贴，防止口溶膜漂浮或粘壁，用于考察不同释药类型无水茶碱口溶膜的溶出度。
本研究在其基础上进行了优化，设计了3款固定装置 ( 图 7)。装置1和装置 2 采用双侧夹子固定口溶膜，其中装置 2 多出1个背板结构；装置3不使用胶布，而是采用2层滤网 (22.6mm×30mm，420μm) 夹住口溶膜，并使用 2 个对称空心半圆柱体元件使“滤网-口溶膜- 滤网”结构处于与溶出介质流动方向垂直的位置。以500mL水为溶出介质，在流速2 mL/min、填充玻璃珠6.5g的条件下，分别使用上述3款固定装置进行溶出试验，并与“3.4.2.1” 项下方式3所得结果对比。
图7 优化后的固定装置
结果如图7所示，使用装置1与2时，1溶出速率相似，但装置1缺乏背板结构，导致固定能力不佳，试验过程中观察到部分样品出现了折断、漂浮等情况，溶出数据的离散度较高。同时，装置1和2的夹子结构导致样品与溶出介质的接触不均匀，变异性较高。而采用装置3可将样品平展于滤网中，能保证溶出介质均匀、平行地冲刷样品表面，且滤网在一定程度上能减缓药物的溶出。因此，后续试验选用装置3固定样品。
图8 不同固定方式测得的样品溶出曲线(n=6)
3.4.2.3 流速优化
流池法中介质的流速对药物的溶出速率起决定性影响。采用装置3固定样品，以水为溶出介质，玻璃珠填充6.5 g，分别在 2、4、8、16 mL/min 的流速下考察 1 口溶膜的溶出度。结果(图 9) 显示，流速为8和16 mL/min 的条件下，药物在15min内溶出达85％，表明方法的区分力不理想 ；流速为2mL/min 时则药物溶出较慢，60 min溶出度才达84.6％。同时，考虑到低流速下溶出仪输液泵的精度受限，故选择4mL/min为流速进行后续试验。
图9 不同流速测得的样品溶出曲线(n=6)
3.4.2.4 溶出介质筛选
采用流池法，取4种溶出介质各500mL，设置介质流速为 4 mL/min，采用装置3固定样品，玻璃珠按方式3填充 6.5g，比较1口溶膜在不同溶出介质中的溶出行为，结果如图10所示。在pH 4.5乙酸盐缓冲液中，样品溶出略快，在水、pH 6.8 PBS、人工唾液中的溶出行为则无明显差异。由于人工唾液在一定程度上可模拟口腔生理条件，故选用人工唾液作为后续试验的溶出介质。
图10 不同溶出介质下测得样品的溶出曲线(n=6)
3.5 溶出度评价
取3批样品，每批6份，采用流池法的闭环模式，以人工唾液 500 mL为溶出介质，用装置3固定口溶膜，填充玻璃珠6.5g，使用2.7和0.7μm 玻璃纤维滤膜过滤，设置介质流速为4 mL/min，温度为37 ℃，进行试验。分别于2、5、10、15、30、45、60 min时取样，按“3.1”项下色谱条件进样测定，结果如图11所示。3批样品在60 min 内均能稳定、完全地溶出，批间差异小 ；批内各时间点溶出度的RSD均在10％以下，表明均一性良好。
图 11 3 批样品的溶出曲线 (n=6)
总 结
在膜剂开发的初期评估中，溶出度通常被列为高风险质量属性。1属于第二类精神药品，日均剂量为2.5μg ；微小的溶出行为差异对其疗效、不良反应风险均有显著影响。开发具有区分力的溶出度评价方法有利于1口溶膜的处方筛选和质量控制，确保临床用药的安全性和有效性。
本研究基于ChP 2025年版四部通则0931第四法、第六法，对转速、流速、溶出介质、固定方式等试验条件进行优化，选择了区分力更强且不涉及机械搅拌的流池法作为 1口溶膜的溶出度试验方法，并使用人工唾液作为溶出介质模拟口腔生理条件。针对口溶膜质软、易漂浮的特点，设计了适用于22.6mm池体的固定装置，装置外观形状与池体圆柱体部分吻合，无需额外固定手段，同时允许锥体部分填充玻璃珠，确保介质流动模式为层流。本法可使口溶膜在试验过程中保持垂直状态，并与溶出介质流动方向平行，更贴近药物在口腔内给药后被唾液逐步润湿的过程。随后，采用该方法评价了3批1口溶膜样品的溶出度，结果显示3批样品的溶出行为平稳，批间一致性良好。这表明该方法可在一定程度上预测1口溶膜的体内性能，对后续的生物等效性试验、适口性评价、临床试验具有一定的指导意义。
需注意的是，近几年国内外越来越多的研究致力于将纳米颗粒、纳米晶体、微粉等技术应用于口溶膜的制备 ，尝试负载中草药提取物、益生菌、疫苗等不同活性成分，开发出具有缓释、控释等不同类型的口溶膜，进一步拓展了该剂型的应用范围。 在面对不同种类、不同释药性能的口溶膜时，需根据实际情况对现有溶出试验装置和方法进行优化，以改善其区分力和方法适用性，达到准确评价产品质量的目的。
参 考 文 献
国家药品审评中心．化学药品口溶膜剂药学研究技术指导原则(试行)[EB/OL]．(2025-07-29)[2025-12-01]．https://www．cde．org．cn/main/news/viewInfoCommon/e9ca411c6 e11df700933b13e3764f783．
